Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова
Биологический факультет
Кафедра биофизики

119991, Москва, ГСП-2, Ленинские горы. Телефон (495) 939-1116, факс 939-1115.
!Поздравляем старшего научного сотрудника кафедры биофизики Надежду Александровну Браже с победой в конкурсе «For Women in Science» и премией ЮНЕСКО за 2015 год!

Учебные дисциплины

Спецпрактикум по выбору

Задача №1. Применение эффекта плазмонного резонанса для исследования свойств мембранносвязанного гемоглобина в интактных эритроцитах с использованием спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (surface-enhanced Raman spectroscopy) с наночастицами серебра. Браже Н.А.

Задача №2. Методы приготовления и анализа моноламеллярных липосом. Паршина Е.Ю.

Задача №3. Методы прижизненной модификации липидного состава плазматических мембран интактных клеток и способы оценивания микровязкости липидного матрикса биологических и искусственных мембран. Лунева О.Г. (временно ведут Браже Н.А. и Паршина Е.Ю.)

Задача №4. Проникновение наноразмерных молекул метилвиологена в растительную клетку под действием возбуждения,  вызванного электрическим стимулом. Крупенина Н.А.

Задача №5. Модификация антиоксидантного статуса крови наночастицами серебра в экспериментах in vitro. Байжуманов А.А.

Задача №6. Исследование пространственных структур в БЖ-АОТ микроэмульсиях. Черкашин А.А.

Задача №7. Влияние наноматериалов на функционирование миелиновых нервных волокон. Браже А.Р.

Задача №8. Регистрация наноразмерных изменений конформации гемоглобина в эритроцитах. Юсипович А.И.

Задача №9. Применение пикосекундной спектрофлуориметрии для исследования процессов миграции энергии в гибридных комплексов из пигментов и квантовых точек. Максимов Е.Г.

Задача №10. Компьютерное моделирование углеродной нанотрубки. Зленко Д., Мамонов П.

Задача №11. Современные методы компьютерного моделирования белок-белковых взаимодействий. Коваленко И.Б., Дьяконова А.Н.

Задача №12. Исследование транспорта веществ через мембрану эритроцитов методом остановленной струи. Локтюшкин А.

Задача №13. Индукция флуоресценции хлорофилла мономерной и димерной форм комплекса ФС2. Конюхов И.

Задача №14. Взаимодействие между углеродными нанотрубками и частицами фотосистемы 2. Семин Б.К., Давлетшина Л.Н.


Задача №1.

Применение эффекта плазмонного резонанса для исследования свойств мембранносвязанного гемоглобина в интактных эритроцитах с использованием  спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (surface-enhanced Raman spectroscopy) с наночастицами серебра

Одним из актуальных направлений нанобиотехнологий является создание наночастиц-биосенсоров, использующихся в биомедицинских  исследованиях для усиления сигнала (интенсивности флуоресценции и комбинационного рассеяния (КР) света), регистрируемого от объектов: клеток, белков и нуклеиновых кислот, биологических мембран и низкомолекулярных компонентов клетки. В спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР, англ. SERS – surface enhanced Raman spectroscopy) к исследуемому объекту добавляют наночастицы (НЧ) серебра или золота, на поверхности которых возникают плазмонный резонанс и перенос заряда,  что приводит к увеличению рамановского сечения исследуемых молекул более, чем в 105-106 раз. Упомянутые эффекты позволяют исследовать конформацию молекул при концентрации менее 10-6-10-8 М. Плазмонный резонанс на поверхности НЧ возникает только тогда, когда расстояние между НЧ и исследуемой молекулой составляет не более чем 15-20 нм, что дает возможность говорить о пространственной локализации регистрируемого сигнала ГКР. Перспективным является применение спектроскопии ГКР для исследования конформации биомолекул внутри отдельных живых интактных клеток, прикрепленных к подложке, или внутри клеток, находящихся в суспензии. Изменение конформации биомолекул позволяет судить о структуре и свойствах микроокружения данных молекул и отражает функциональное состояние клетки в целом.

Цель задачи: освоение метода ГКР в применении к живым клеткам и сравнительное исследование конформации и кислород-связывающих свойств мембранносвязанного и цитоплазматического гемоглобина (Гб) в интактных эритроцитах в контроле и при модификации свойств плазматической мембраны.

Объекты исследования: эритроциты крысы и изолированный цитоплазматический гемоглобин.

Методы: спектроскопия ГКР с использованием наночастиц серебра, традиционная спектроскопия КР и абсорбционная спектроскопия.

План работы:

  1. Получение коллоидного раствора серебра путем восстановления AgNO3 гидроксиламином гидрохлоридом и нахождение оптимальных условий реакции. Определение размеров наночастиц серебра по спектрам поглощения коллоидного раствора, а также при помощи анализатора частиц Zetasizer Nano.
  2. Определение концентрации эритроцитов в исследуемой пробе и  соотношения объемов суспензии эритроцитов и коллоидного раствора серебра для получения максимального сигнала ГКР от гемоглобина в интактных эритроцитах. Нахождение оптимальных условий, при которых НЧ серебра не влияют на свойства эритроцитов.
  3. Применение традиционной спектроскопии КР для изучения конформации и свойств гемоглобина в интактных эритроцитах и сравнение спектров ГКР и КР.
  4. Изолирование цитоплазматического гемоглобина из эритроцитов и нахождение оптимальных условий ГКР спектроскопии для исследования изолированного Гб. Сопоставление спектров ГКР от эритроцитов и изолированного Гб.
  5. Получение эритроцитов с увеличенным содержанием холестерина в плазматической мембране путем инкубации эритроцитов с липосомами, содержащими холестерин.
  6. Получение спектров КР и ГКР от гемоглобина в эритроцитах с повышенным содержанием холестерина. Анализ влияния вязкости и липидного состава плазматической мембраны эритроцитов на конформацию и О2-связывающие свойства мембранносвязанного и цитоплазматического Гб в эритроцитах.
  7. Применение различных алгоритмов для обработки КР и ГКР спектров и вычитания базовой линии.

Предполагаемые результаты и навыки:

l  Освоение методов ГКР и КР в применении к интактным эритроцитам и гемоглобину и методики приготовления коллоидного раствора серебра;

l  Приобретение навыков анализа спектров КР и ГКР гемоглобина с оцениванием изменений конформации Гб и его О2-связывающих свойств.

l  Полученные результаты продемонстрируют зависимость конформации и свойств Гб от места его локализации в клетке. Задача ознакомит нанотехнологов, физиков и химиков с особенностями применения наночастиц в спектроскопии ГКР и оптических методах для исследования свойств живых клеток, а биологов — с возможностью  получать дополнительную информацию о структуре и свойствах биомолекул при использовании наночастиц серебра или золота.


Задача №2. Методы приготовления и анализа моноламеллярных липосом.

Липосомы – искусственные частицы, образованные одним или несколькими концентрическими замкнутыми липидными бислoями, ограничивающими внутреннюю водную вазу от внешней среды. Моноламеллярные липосомы состоят из одного бислоя. Различают малые моноламеллярные (диаметр 20-50 нм) и большие моноламеллярные (диаметр 50-200 нм и выше). В бионанотехнологии наноразмерные липосомы используются в качестве средств доставки биологически активных веществ в клетки, при этом активное вещество может быть как заключено во внутреннем объеме липосомы (в водной среде), так и включено в состав липидного бислоя. Варьируя состав липосомальной мембраны можно реализовать адресную доставку содержимого липосом. Кроме того, липосомы широко используются как модельные объекты для экспериментальных исследований биологических мембран.

Существуют различные способы приготовления липосом. Для формирования наноразмерных липосом – малых и крупных моноламеллярных – требуется обработка ультразвуком или экструзия.

Цель работы:изучение методов получения липосом и определения их размеров и структурного состояния мембраны, использование липосом для насыщения мембраны эритроцитов холестеролом.

Объекты исследования:моноламеллярные липосомы, эритроциты млекопитающих.

Используемые методы:методы ультразвуковой обработки и экструзии (приготовление липосом); динамическое светорассеяние; спектроскопия комбинационного рассеяния (КР); сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ).

План работы:

1. Изучение общих принципов и подходов в приготовлении липосом и приготовление липосом из гомогенизированной в буфере смеси фосфолипидов  и гидратированной липидной пленки путем ультразвуковой обработки и экструзии, с включением в состав липидного бислоя молекул каротина и холестерола.

2. Изучение основ метода динамического светорассеяния и определение размера приготовленных липосом.

3. Анализ структуры мембраны приготовленных липосом при помощи спектроскопии КР. Упорядоченность мембраны оценивается по спектрам жирнокислотных цепей фосфолипидов, входящих в состав липосом.

4. Анализ структуры мембраны липосом по спектрам резонансного КР инкорпорированных в липидный бислой молекул каротина, изучение подходов к обработке спектров КР.

5. Изменение структуры мембраны липосом при действии различных факторов (изменение температуры или добавление мембранотропных соединений).

6. Исследование размера и формы липосом при помощи СЗМ.

7. Насыщение мембраны эритроцитов млекопитающих холестеролом при помощи липосом с различным содержанием холестерина, наблюдение изменений формы эритроцитов, наблюдение изменения вязкости мембран эритроцитов при насыщении холестеролом (в задаче про электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)).

Предполагаемые результаты:в процессе выполнения задачи студенты освоят методы приготовления моноламеллярных липосом, методы анализа их размеров и структуры мембран (динамическое светорассеяние, СЗМ, КР). Будут получены малые моноламеллярные липосомы, определены их размеры и структурное состояние их мембран, что позволит выбрать условия приготовления липосом с заданными свойствами. Будет освоена методика насыщения мембран клеток липидорастворимыми биологически активными веществами (на примере насыщения мембран эритроцитов холестеролом).


Задача №3. Методы прижизненной модификации липидного состава плазматических мембран интактных клеток и способы оценивания микровязкости липидного матрикса биологических и искусственных мембран

Биологические мембраны представляют собой гетерогенные бислойные наноструктуры толщиной около 10 нм, имеющие сложное строение и выполняющие целый ряд важнейших функций, большинство из которых зависят от физико-химических свойств липидного матрикса: проницаемость мембраны для малых молекул, механические свойства мембраны, активность мембранных белков зависит от свойств аннулярных липидов. Биологические мембраны имеют гетерогенную структуру как в латеральном, так и в направлении нормали к поверхности. До 9-го атома углерода (около 1,2 нм от поверхности мембраны) жирнокислотные остатки фосфолипидов упакованы очень плотно, так как не имеют двойных связей, в то время как после 9-го атома углерода двойные связи присутствуют и мембраны имеют более «рыхлую» структуру.

Во многих биотехнологических исследованиях стоит задача направленной модификации свойств и состава плазматической мембраны живых клеток и последующий контроль эффективности проведенной модификации. Одним из способов изменения свойств мембран клеток является ко-инкубация клеток с липосомами, мембрана которых имеет необходимый липидный состав и которые могут содержать вещество, необходимое для перенесения в цитоплазму клеток. Детальное изучение липидного состава, физических и химических свойств и молекулярной организации плазматической мембраны клеток может выполняться с использованием метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Применение спиновых зондов на основе стеариновой кислоты с различным расположением парамагнитного фрагмента позволяет получить уникальную информацию об изменении физико-химических свойств липидного матрикса, в частности микровязкости, на разной глубине от поверхности и, таким образом, успешно контролировать эффективность модификации липидного состава плазматической мембраны живой клетки.

Цель работы.

1. Ознакомиться с устройством спектрометра ЭПР и зарегистрировать спектры ЭПР спиновых зондов 5- и 16-доксилстеариновой кислоты в искусственных мембранах липосом разного состава, а также в мембранах живых клеток, подвергнутых различным воздействиям, в частности, в плзаматической мембране эритроцитов с пониженным и повышенным содержанием холестерина.

2. По полученным спектрам ЭПР оценить микровязкость биологических и искусственных мембран на глубине 0,6-0,8 нм и 2,2-2,4 нм от поверхности мембраны в различных условиях.

Объекты исследований.

Эритроциты с нормальным и сниженным содержанием холестерина, липосомы, приготовленные разными способами, в том числе с холестерином и без него.

Методы.

ЭПР-спектроскопия спиновых зондов 5- и 16-доксилстеариновых кислот (5-ДС и 16-ДС), встроенных в биологические и искусственные мембраны.

План работы.

1. Подготовка объектов для работы: выделение эритроцитов из цельной крови и экстракция холестерина; в качестве искусственных мембран используем липосомы, приготовленные в задаче № 2.

2. Знакомство с устройством спектрометра ЭПР, освоение навыков приготовления образцов для ЭПР спектроскопии и записи спектров.

3. Регистрация спектров ЭПР 5- и 16-ДС, встроенных в плазматическую мембрану контрольных эритроцитов и эритроцитов со сниженным и повышенным содержанием холестерина, а также эритроцитов, предварительно инкубированных с лидокаином.

4. Регистрация спектров ЭПР 5- и 16-ДС, встроенных в мембраны липосом, приготовленных различными способами, в том числе содержащих холестерин.

5. Обработка полученных спектров ЭПР, оценка  микровязкости липидного матрикса различных образцов.

Предполагаемые результаты.

l  Спектры ЭПР спиновых зондов 5- и 16-ДС, встроенных в мембрану эритроцитов имеют различную форму, что обусловлено различной скоростью вращения нитроксильных фрагментов в областях на глубине 0,6-0,8 нм и 2,2-2,4 нм от поверхности мембраны. Снижение содержания холестерина в мембране эритроцитов приводит к уменьшению микровязкости липидного матрикса в двух исследуемых областях мембраны, в то время как обработка эритроцитов лидокаином, молекулы которого преимущественно распределяются в глубоких областях мембраны, приводит к увеличению микровязкости только в области 2,2-2,4 нм от поверхности мембраны.

l  Спектры ЭПР спиновых зондов 5- и 16-ДС, встроенных в мембраны липосом имеют, в отличие от биологических мембран, практически одинаковую форму, так как двойные связи присутствуют по всей длине ацильных цепей фосфолипидов, по этой причине искусственные мембраны не имеют столь выраженной гетерогенности, присущей биологическим мембранам. В мембранах липосом, приготовленных различными способами, возможны различия в микровязкости, так как липосомы отличаются диаметром, а следовательно имеют различную кривизну поверхности. Присутствие холестерина в искусственных мембранах, так же как и в биологических, ведет к увеличению микровязкости липидного матрикса.

Навыки

Студенты познакомятся со способами прижизненной модификации липидного состава плазматической мембраны клеток на примере эритроцитов, освоят метод ЭПР с использованием спиновых зондов и проведут сравнительное исследование микровязкости мембраны эритроцитов с нормальным, пониженным и повышенным содержанием холестерина и сделают выводы об эффективности используемых способов модификации мембраны.


Задача №4: Проникновение молекулы метилвиологена в растительную клетку под действием возбуждения, вызванного электрическим стимулом

Метилвиологен (N,N'-диметил-4,4'-дипиридин дихлорид) — это гербицид, известный также под названием паракват, который широко используется в сельском хозяйстве для борьбы с сорняками во многих странах мира. Губительное действие МВ на растения объясняется тем, что МВ, попадая в хлоропласты, принимает электроны от Fe-S центров на акцепторной стороне фотосистемы I и приводит к образованию радикальных форм кислорода. В растворе МВ  находится в виде двухвалентно заряженных молекул, линейные размеры которых составляют около 0.6×1.2 нм. В настоящее время не до конца понятно, каким образом  МВ попадает в хлоропласты, преодолевая мембранные барьеры клетки (плазмалемма и оболочка хлоропласта). Для исследования этой проблемы удобно использовать важное свойство растений — способность генерировать потенциал действия (ПД) в ответ на различные стимулы. Имеются данные, что ПД резко ускоряет проникновение МВ в хлоропласты нативной клетки.

Цель задачи: С помощью нескольких независимых методов изучить влияние потенциала действия (ПД) на фотохимическую эффективность фотосистем I и II, а также мембранный потенциал плазматической мембраны растительных клеток, обработанных метилвиологеном.

Объект: клетки харовой водоросли Chara corallina

Методы: Измерение флуоресценции хлорофилла методом импульсно-модулированной флуориметрии (Microscopy PAM); измерение мембранного потенциала плазмалеммы; измерение кинетики фотоокисления хлорофилла реакционного центра фотосистемы I Р700.

План работы:

Предполагаемые результаты: Предполагается освоение студентами предложенных методов. Планируется показать, что ПД, вызывнный одиночным электрическим стимулом, облегчает проникновение МВ в хлоропласты растительной клетки и переключает фотосинтетический (НАДН-зависимый) поток электронов на восстановление этого экзогенного акцептора. Предлагается также обсудить возможный механизм проникновения наноразмерных молекул МВ к хлоропластам клетки Chara.


Задача №5. Модификация антиоксидантного статуса  крови наночастицами серебрав экспериментах in vitro

В последнее время в медицине и биологии начали широко использовать коллоидные растворы серебра. При употреблении препаратов содержащих наночастицы серебра - часть из них попадает в кровь. Ряд современных исследований убедительно доказывает негативные цитотоксические эффекты наночастиц серебра, при этом механизм их цитотоксичности не ясен. Известно, что одними из веществ индуцирующими цитотоксичность являются активные формы кислорода. Основными антиоксидантными ферментами крови являются супероксиддисмутаза и каталаза. Супероксиддисмутаза  катализирует дисмутацию супероксидных анион-радикалов. В крови млекопитающих Cu,Zn- содержащая СОД расположена в основном в эритроцитах, где присутствуют в виде димеров Мr 31300; каждая субъединица содержит один атом меди и один атом цинка. Каталаза катализирует окислительно-восстановительную реакцию, в ходе которой из 2 молекул перекиси водорода образуются вода и кислород. Каталаза (Mr 250000) относится к хромопротеидам, имеющим в качестве простетической (небелковой) группы окисленный гем.Активности каталазы и СОД коррелируют между собой, что возможно связано с переключением потока электронов с одной цепи транспорта на другую. Сдвиг  в работе антиоксиданных ферментов приводят к увеличению или снижению активных форм кислорода, что соответственно приводит в итоге к изменениям в содержании конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Цели работы: изучить, как коллоидные растворы влияют на активности основных антиоксидантных ферментов крови и содержание конечных продуктов ПОЛ..

Объект исследования:гемолизаты крови, плазма крови, наночастицы серебра

Используемые методы: метод золь-гель*; метод поверхностного плазменного резонанса*; метод динамического светорассеяния*; спектрофотометрический метод определения активности супероксиддисмутазы; спектрофотометрический метод определения  активности каталазы; гемихромный метод определения концентрации гемоглобина, спектрофотометрический метод определения количества конечных продуктов ПОЛ.

План работы:

1. Получить коллоидные растворы серебра с разными размерами наночастиц*.

2. Оценить размеры наночастиц по положению пика плазменного резонанса  на спектрах поглощения и при помощи метода динамического светорассеяния*.

3. Выделить кровь и получить гемолизаты крови и плазму крови.

4. Освоить методику  определения супероксиддисмутазной активности гемолизатов крови

5. Освоить методику  определения каталазной активности гемолизатов крови

6. Освоить гемихромный метод определения концентрации гемоглобина.

7. Освоить методику определения конечных продуктов ПОЛ.

6. Инкубация крови с коллоидными растворами серебра и определение модифицированной активности антиоксидантных ферментов и продуктов ПОЛ.

Предполагаемые результаты:

В процессе работы студенты освоят методы получения коллоидных растворов с разным размером наночастиц серебра. Научаться выделять кровь, получать гемолизаты крови, определять активность антикосидантных ферментов.  Выяснят, как влияют нанообъекты на  антиоксидантный статус крови млекопитающих.

* В случае, если не выполняется задача № 1


Задача №6. Исследование пространственных структур в БЖ-АОТ микроэмульсиях

Диссипативные структуры (ДС) играют важную роль в таких важных процессах как морфогенез и динамика популяций и поэтому представляют большой теоретический интерес для биологии. Особую роль в исследовании ДС играет модельная химическая реакция Белоусова-Жаботинского (БЖ-реакция). Если реагенты БЖ-реакции заключить в нано-капли (размером 2-100 нм) водной фазы, диспергированной в органической фазе (октан) при участии поверхностно-активного вещества (АОТ), количество разных типов диссипативных  структур, возникающих в такой системе, возрастает во много раз. Помимо различных типов волн, наблюдаются стационарные структуры Тьюринга и даже колебательные структуры Тьюринга, локальные структуры и хаотические режимы. Важным условием появляения такого разнообразия структур является размер и концентрация медленно диффундирующих в октане (по сравнению с быстро диффундирующими неполярными интремедиатами) нано-капелек водной фазы. Кроме того, переходами между различными структурами можно управлять, к примеру, температурой реактора.

В БЖ-АОТ системе, катализируемой батофенантролином, наблюдается принципиально новый класс концентрационных волн, прыгающие волны (ПВ). Эти волны распространяются в пространстве дискретными скачками. В этом классе выделяют три подтипа волн: непосредственно прыгающие волны (ПВ), волны пузырьков (ВП) и вращающиеся волны (ВВ). Все они распространяются в пространстве прыжками (длина прыжка в наших опытах составляла 100 – 250 мкм). Переход от обычных распространяющихся непрерывно и равномерно триггерных волн к прыгающим волнам контролируется температурой.

При высоких температурах (40-50 оС) ВВ, ПВ и ВП превращаются в хаотические волны.

В БЖ-АОТ системе, катализируемой металлокомплексом Ru(bpy)3, наблюдается переход от стационарных структур Тьюринга (при 15 – 25 оС) к волнам и хаотическим волнам (при 50 оС) при температурно-индуцированном перколяционном переходе. При промежуточных температурах найдены новые диссипативные структуры: “колебательный Тьюринг” (при 35 – 40 оС) и “обращенный колебательный Тьюринг” (при 45 – 50 оС). В отличие от стационарных структур Тьюринга, периодически распределенные в пространстве концентрационные пики колеблются во времени с определенным периодом и в отличие от стоячих волн эти пики-максимумы не меняют свое положение в пространстве (для стоячих волн характерно постоянное положение узлов, но не пиков). Для структур “обращенный колебательный Тьюринг” характерно колебание минимумов.

Цель работы.

Исследовать различные типы диссипативных структур в БЖ-АОТ системе в зависимости от  размера нано-капель водной фазы и переходы между структурами, вызванные внешними воздействиями (изменение температуры, освещение).

Объекты исследований.

Микроэмульсии АОТ нагруженные реагентами БЖ-реакции. В качестве катализаторов используются ферроин, батофенантролин и Ru(bpy)3.

Методы.

В работе используется специальный реактор, позволяющий быстро изменять и контролировать температуру в широком диапазоне величин (0-60оС). Диссипативные структуры, самообразующиеся в тонком слое микроэмульсии наблюдают через микроскоп, снабженный CCD камерой. Компьютерная программа регистрирует как отдельную динамику процесса. Основной методологический подход состоит в контроле переходов между различными диссипативными структурами в БЖ-АОТ системе при помощи изменения размера нано-капель водной фазы микроэмульсии и температуры, которая вызывает перколяционный переход, существенно изменяющий нано-структуру микроэмульсии.


Задача №7. Влияние наноматериалов на функционирование миелиновых нервных волокон

Миелиновое нервное волокно представляет собой удобную тестовую систему для оценки нанобезопасности биологических систем. С одной стороны, объект относительно стабилен и прост в приготовлении, а с другой — позволяет выявить влияние различных агентов на работоспособность нервной ткани. Наиболее чувствительным элементом миелинизированных нервных волокон является паранодально-нодальный комплекс, т.е. перехват Ранвье, окружающие его ламеллы шванновских клеток и близлежащие области, образующие плотный контакт мембран шванновской клетки с мембраной аксона. Наноразмерные изменения белков ( ионные каналы и насосы) и липидов миелина могут привести к патологическому состоянию т.н. фокальной демиелинизации, которая сопровождается нарушением архитектуры паранодально-нодального комплекса и потерей способности к нормальному проведению нервных импульсов.

Работа нервных волокон в режиме проведения ритмического возбуждения сопровождается относительно медленными метаболическими процессами. Важным маркером таких процессов является перераспределение мембранносвязанного Ca.

Цель работы: Исследовать влияние коллоидных наночастиц серебра, и/или других наночастиц на: порог возбуждения;  форму потенциалов действия; устойчивость при проведении ритмического возбуждения; изменение содержания мембранносвязанного Ca на фоне ритмической активности

Объект: Работа проводится на цельных седалищных нервах травяной лягушки Rana temporaria и изолированных нервных волокнах.

Методы: Проводится экстраклеточная регистрация потенциалов действия в режимах проведения одиночных потенциалов действия и ритмического возбуждения. В случае отведения от цельного нерва используются металлические макроэлектроды, в случае отведения от изолированных нервных волокон — втягивающие микроэлектроды (suction microelectrodes).

Изменения в уровне мембранносвязанного Ca проводят с помощью зондовой флуоресцентной микроскопии. Морфология изменений миелинового нервного волокна оценивается с помощью лазерной интерференционной микроскопии и атомносиловой микроскопии.

План работы:

1. Приготовление препаратов

Разрушив ЦНС лягушки при помощи зонда приготовить препарат седалищных нервов лягушки. Для одного из нервов приготовить препарат одиночных нервных волокон, разрушая соединительнотканую оболочку нерва и разделяя отдельные волокна при помощи тонкого стеклянного капилляра.

2. Регистрацияпотенциалов действия

Далее проводят регистрацию составных потенциалов действия в контроле и при добавлении наночастиц. Определяют основные параметры возбуждения: порог, реобазу, хронаксию, исследуют форму потенциалов действия.

3. Изменения содержания мембранносвязанного Ca

С использованием зонда хлортетрациклина наблюдают динамику уровня мембранносвязанного Ca на фоне ритмического возбуждения в норме и при внесении наночастиц.

Предполагаемые результаты

По выполнении данной практической программы обучающиеся приобретут навыки работы с препаратами нервных волокон, оценки их функционального состояния и с помощью данной тестовой системы смогут оценивать уровень токсичности наноматериалов для нервной ткани.


Задача №8. Регистрация наноразмерных изменений  конформации гемоглобина в эритроцитах

Живая клетка - единый хорошо сбалансированный механизм, регуляция которого осуществляется на различных уровнях организации: макро – изменение размеров и формы клетки; микро – оценка состояния клеточных органелл; и нанометровом диапазоне – изменение характеристик молекулярных связей веществ, входящих в клетку. Использование одной из разновидностей лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) в сочетании со спектроскопией комбинационного рассеяния (КР) позволяет оценить состояние клетки на различных уровнях ее организации. Особенности применения комплексной методики проиллюстрированы на примере эритроцитов крысы в условиях invitroпри изменении осмолярности раствора. Основной функцией эритроцитов, является транспорт кислорода к тканям и органам, которая осуществляется за счет содержащегося в эритроцитах специального белка – гемоглобина. Способность  гемоглобина связывать кислород во многом зависит как от состояния порфиринового макроцикла и спинового состояния атома железа, так и  от состояния самого эритроцита. Таким образом, изменение окружающих условий (нанобезопасность)  влияет на состояние эритроцитов и, соответственно, на состояние гемоглобина, что в свою очередь влияет насыщение тканей кислородом и сказывается на всем организме в целом.

Цель задачи: Методами ЛИМ и спектроскопии КР оценить состояние эритроцитов крысы invitro  при изменении осмолярности раствора.

Используемые методы: метод лазерной интерференционной микроскопии; метод спектроскопии комбинационного рассеяния; атомносиловая микроскопия;

План работы:

1. Освоение методики лазерной интерференционной микроскопии; проведение измерений; определение формы, объема, показателя преломления отдельных эритроцитов, а также оценка содержания гемоглобина в клетке; статистическая обработка и интерпретация результатов.

2. Освоение методики спектроскопии комбинационного рассеяния; проведение измерений; определение, с использованием отношений интенсивностей пиков отношение окси/дезоксигемоглобин в клетки, а также способности гемоглобина связывать и отдавать кислород на уровне молекулярных связей при изменении осмолярности раствора; статистическая обработка и интерпретация результатов.

3. Сопоставление результатов, полученных методом ЛИМ и КР, при изменении осмолярности, оформление и сдача задачи.

Ожидаемые результаты:

Наблюдается изменение объема эритроцитов при изменении осмолярности окружающего раствора. Это приводит к изменению концентрации гемоглобина в клетке (определяемого по изменению показателя преломления), а также к перераспределению концентрации калия и хлора внутри клетки. Это приводит к изменению состояния гемоглобина, что выражается в изменении конформации гемопорфиринового кольца и, соответственно, приводит к изменению сродства гемоглобина к кислороду на молекулярном уровне. Содержание гемоглобина остается неизменным.


Задача №9. Применение пикосекундной спектрофлуориметрии для исследования процессов миграции энергии в гибридных комплексах из белков и квантовых точек

Современные нанотехнологии позволяют синтезировать полупроводниковые CdSe/ZnS нанокристалы или так называемые «квантовые точки» со строго определенными характеристиками спектров поглощения и флуоресценции. Положение максимума спектра флуоресценции квантовой точки зависит от размеров полупроводникового «ядра». Оболочка из полиэтиленгликоля, функционализированная карбоксильными группами позволяет работать с водными растворами квантовых точек.  Эти свойства (а также высокие квантовые выходы флуоресценции) позволяют использовать квантовые точки в качестве флуоресцентных зондов. Перспективным является применение спектрофлуориметрии для изучения свойств гибридных систем, состоящих из квантовых точек и природных пигмент-белковых комплексов. Исследование спектральных характеристик таких систем позволяет оценить эффективность миграции энергии (FRET).

Цель задачи: освоение метода спектрофлуориметрии в применении к гибридным системам, состоящих из квантовых точек и фикобилипротеинов цианобактерий.

Объекты исследования: квантовые точки Y530 и R630, фикоэритрин и С-фикоцианин.

Методы: абсорбционная спектроскопия, спектрофлуориметрия.

План работы:

1. Регистрация спектров поглощения растворов квантовых точек и фикобилипротеинов, определение концентраций исходных растворов.

2. Регистрация спектров флуоресценции квантовых точек и фикобилипротеинов.

3. Расчет интегралов перекрывания спектров флуоресценции доноров и спектров поглощения акцепторов. Определение ферстеровского радиуса для системы донор-акцептор.

4. Анализ спектров поглощения квантовых точек и фикобилипротеинов. Выбор длинны волны возбуждающего света для регистрации спектров флуоресценции.

5. Регистрация спектров флуоресценции гибридных систем с различным содержанием (стехиометрией) квантовых точек и фикобилипротеинов.

6. Анализ спектров флуоресценции гибридных систем. Оценка зависимости тушения флуоресценции квантовых точек.

7. Расчет эффективности и константы миграции энергии для соответствующих комплексов.

Предполагаемые результаты и навыки:

l  Освоение метода спектрофлуориметрии в применении к гибридным системам, состоящих из квантовых точек и фикобилипротеинов цианобактерий;

l  Приобретение навыков анализа спектров поглощения и флуоресценции квантовых точек и фикобилипротеинов, а также расчета интегралов перекрывания спектров, оценки ферстеровских радиусов и эффективности FRET;

l  Полученные результаты продемонстрируют возможность использования наноразмерных квантовых точек для увеличения поглощающей способности природных фикобилипротеинов.


Задача №10. Компьютерное моделирования углеродной нанотрубки

Методы молекулярного моделирования в настоящее время стали универсальным инструментом изучения молекулярных комплексов и наноструктур, позволяющим решать широкий класс задач, зачастую недоступных экспериментальным методам. Методы молекулярного моделирования широко используются для исследования свойств и проектирования наноструктур.

В рамках данной задачи студентам предлагается исследовать молекулярно-механическую модель углеродной нанотрубки. Исследование предполагает моделирование ее упругих свойств, а также проницаемости для воды и ионов. В ходе выполнения задачи студенты приобретают навыки манипуляции молекулярными моделями, получают представление об особенностях численной реализации методов классической механики применительно к атомным системам, знакомятся с различными методиками проведения вычислительного эксперимента.

Цель задачи:освоение молекулярно-механического метода моделирования наноструктур

Объекты исследования: молекулярно-механическая модель нанотрубки

Методы: полноатомное молекулярномеханическое моделирование

План работы:

Создание молекулярно-механической модели углеродной нанотрубки.

Расчет спектра нормальных колебаний углеродной нанотрубки.

Исследование упругих свойств углеродной нанотрубки методом управляемой молекулярной динамики.

Молекулярно-динамическое исследование проницаемости модели нанотрубки для воды и ионов.

Предполагаемые результаты и навыки:

  1. Знакомство с молекулярно-механическим подходом к описанию наноструктур.
  2. Получение навыков манипуляции атомными моделями.
  3. Освоение  пакета программ для молекулярно-механического моделирования GROMACS.
  4. Знакомство с основными методиками молекулярно-механического моделирования: оптимизация геометрии, расчет нормальных колебаний, молекулярная динамика, управляемая молекулярная динамика.
  5. Обработка и интерпретация результатов численного эксперимента.

Список оборудования:

  • x86 совместимая ПЭВМ, оснащенная АЛУ класса Intel Pentium‑IV,  работающая под управлением POSIX совместимой ОС (например GNU/Linux)
  • Программа для визуализации и редактирования молекулярных структур PyMol
  • Программа для квантовохимических расчетов GAMESS
  • Пакет программ для молекулярномеханического моделирования GROMACS
  • Интерактивная программная среда для технических расчетов (например Matlab, Scilab, GNU Octave)

Задача №11. Современные методы компьютерного моделирования белок-белковых взаимодействий.

Цель работы: освоение метода и изучение возможностей многочастичной броуновской динамики в применении к описанию кинетики связывания белков.

Описание: Методы компьютерного моделирования находят широкое применение для моделирования наноструктур. В данной работе предлагается освоить метод многочастичной броуновской динамики на примере моделирования связывания белков электрон-транспортной цепи фотосинтеза.

Поведение частиц нано-размера в ансамбле отличается от поведения отдельных атомов и от поведения макротел. В предлагаемой модели описывается взаимодействие сотен частиц, учитываются электростатические взаимодействия, форма частиц и реакционного пространства. Частицы рассматриваются как твердые тела, для описания их движения используется уравнение Ланжевена, для расчета электростатического потенциала - уравнения Пуассона-Больцмана.

Метод много частичной броуновской динамики позволяет изучать влияние формы частиц, их количества, распределения зарядов на частицах, формы реакционного пространства на процесс связывания частиц.

Объекты исследования: PDB структуры белков пластоцианина и цитохрома f.
Используемые методы: многочастичная броуновская динамика.
План работы:
1. Изучение основ метода многочастичной броуновской динамики.
2. Нахождение структуры белков пластоцианина и цитохрома f в базе данных PDB (www.pdb.org).
3. Визуализация трехмерной структуры белков.
4. Расчет зарядов на аминокислотных остатках.
5. Расчет электростатического потенциала вокруг белков и его визуализация.
6. Моделирование движения и связывания белков с помощью программы многочастичной броуновской динамики.
7. Расчет константы связывания белков из модельной кинетической кривой. Сравнение с экспериментальными данными.

Предполагаемые результаты и навыки:
- Освоение метода многочастичной броуновской динамики в применении к описанию кинетики образования белок-белковых комплексов.
- Приобретение навыков визуализации трехмерной структуры белков и электростатического потенциала, анализа кинетических кривых.
- Данная задача продемонстрирует студентам возможность использования метода многочастичной броуновской динамики для изучения процесса связывания белков.


Задача № 12. Исследование транспорта веществ через мембрану эритроцитов методом остановленной струи

Молекулы воды, заключенные в наноразмерные структуры, проявляют свойства, существенно отличающиеся от свойств молекул объемной воды. В связи с этим макроскопическая гидродинамика не может описать течение жидкости через поры, имеющие диаметр порядка нескольких нанометров. Изучение свойств жидкостей в наноразмерных структурах – задача нового научного направления нанофлюидики.

Закономерности переноса воды в наноразмерных системах интенсивно изучаются на углеродных нанотрубках – одном из важнейших объектов нанотехнологий. Несмотря на то, что поверхность нанотрубки гидрофобна, молекулы воды быстро заполняют её внутренний объем. Внутри трубки молекулы воды экранированы от конкурентных взаимодействий, что способствует образованию между ними долгоживущих водородных связей. Таким образом, в нанотрубке образуется цепочка связанных молекул воды. При наличии между концами трубки разности химического потенциала воды, её молекулы должны синхронно перемещаться вдоль оси канала. Оказалось, что скорость этого потока исключительно высока благодаря слабому взаимодействию воды и гидрофобной поверхности нанотрубки. Показано, что скорость потока воды через полимерные мембраны, содержащие нанотрубки, превосходит скорость, предсказываемую макроскопической гидродинамикой, на пять порядков!

Высокоэффективный перенос воды и других веществ через наноразмерные поры наблюдается и в живых системах. Транспорт воды в углеродных нанотрубках можно рассматривать как простую модель функционирования специализированных мембранных белков аквапоринов.

Аквапорины – это семейство интегральных мембранных белков, формирующих поры, через которые проникает вода и ряд других низкомолекулярных неэлектролитов. Белки этого семейства очень широко распространены в живой природе – к настоящему времени обнаружено более 450 различных аквапоринов у представителей всех царств живых организмов от архей до животных. Сходство процессов переноса воды через углеродные нанотрубки и аквапорины обусловлено в первую очередь тем, что водный канал аквапоринов имеет преимущественно гидрофобные свойства.

Первый представитель семейства аквапоринов AQP1 был выделен в 1988 г. из мембраны эритроцитов человека. Наличие именно этого белка обусловливает весьма высокую водную проницаемость мембраны этих клеток. К настоящему моменту показано, что в эритроцитах имеется еще один представитель аквапоринов AQP3. Этот мембранный белок проницаем не только для воды, но и для глицерола.

Проницаемость клеточных мембран для воды и некоторых других незаряженных молекул можно рассчитать, исходя из кинетической кривой изменения объема клетки, помещенной в среду соответствующего состава. В данной задаче этот подход используется для определения коэффициентов проницаемости для воды и глицерола мембраны эритроцитов. Изменение объема эритроцитов можно регистрировать по изменению светорассеяния суспензии клеток при 590 нм.

Цель работы: исследование влияние ингибиторов аквапоринов на проницаемость мембраны эритроцитов для воды и глицерола с помощью метода остановленной струи с фотометрической регистрацией.

Объект исследования: эритроциты позвоночных животных или человека.

План работы:

1. Знакомство с основными принципами и аппаратурой метода остановленной струи. Регистрация кинетической кривой тестовой реакции восстановления 2,6-дихлорофенолиндофенола аскорбиновой кислотой. Определение константы скорости реакции по кинетической кривой.

2. Получение эритроцитарной массы из цельной крови.

3. Регистрация кинетических кривых изменения объема эритроцитов в гипертонической и гипотонической среде (для контрольной суспензии клеток и для суспензии клеток, проинкубированных с ингибитором аквапоринов пХМБ). Определение по кинетическим кривым коэффициента осмотической водной проницаемости мембраны.

4. Регистрация кинетических кривых изменения объема эритроцитов в среде, содержащей глицерол (для контрольной суспензии клеток и для суспензии клеток, проинкубированных с ингибитором AQP3 СuSO4). Оценка коэффициента проницаемости мембраны эритроцитов для глицерола.

Предполагаемые результаты: в ходе выполнения задачи предполагается освоение студентами основных принципов метода остановленной струи, а также некоторых приёмов анализа данных кинетического эксперимента. Полученные коэффициенты проницаемости для воды и глицерола позволят оценить вклад транспорта через липидный бислой, а также вклад транспорта, опосредованного белками, в суммарную проницаемость мембраны эритроцитов для этих соединений.


Задача №13. Индукция флуоресценции хлорофилла мономерной и димерной форм комплекса ФС2

Наименьший комплекс молекулярных структур, способных при освещении создать на тилакоидной мембране поток электронов от молекул воды до НАДФ+, называют фотосинтетической единицей (ФСЕ). Помимо прочих макромолекулярных “машин”, в состав ФСЕ входит фотосистема 2 (ФС2). Она содержит реакционный центр (РЦ), систему разложения воды – кислород-выделяющий комплекс (КВК), и пигмент-белковую светособирающую антенну. Светособирающая антенна представляет собой совокупность трансмембранных белков, которые нековалентно связывают в общей сложности более 100 молекул хлорофилла. Главная роль белковых матриц антенны заключается в том, чтобы поддерживать молекулы хлорофилла в определенной ориентации друг относительно друга. Благодаря этому в мембране создаются условия для обмена энергией возбуждения с малыми потерями между молекулами хлорофилла и между РЦ. По способности к поглощению синего света антенна эквивалентна абсолютно черному телу с площадью до 700 Å2. Эту величину называют эффективным сечением поглощения антенного комплекса - σPSII.

Если фотосинтетические единицы находятся друг от друга на расстоянии более 100 Å, то обмен энергией между ними не возможен. Поэтому поглощение фотонов и передача энергии в РЦ в одной ФСЕ происходят независимо от тех же событий, происходящих в другой ФСЕ. Такие фотосинтетические единицы получили название “изолированных” (isolated PSU).

В том случае, если две ФСЕ или более расположены близко друг к другу, реакционный центр одной ФСЕ может получать энергию возбуждения от соседних ФСЕ. Данные ФСЕ называются “связанными” (connected PSU).

Различная организация ФСЕ экспериментально проявляется в разной форме кинетики перехода реакционных центров ФС2 в закрытое состояние в ответ на включение “ступенькой” постоянного света. Закрытие РЦ сопровождается увеличением квантового выхода флуоресценции хлорофилла ФС2. Индукционная кривая флуоресценции, измеренная от изолированных ФСЕ, в течение 1 мс после включения света имеет вид экспоненты (рис. 1а). При регистрации флуоресценции от связанных ФСЕ, кривая приобретает сигмовидный характер (рис. 1б) за счет того, что при появлении в образце закрытых РЦ, поток энергии к открытым РЦ увеличивается.

О масштабах энергетического сопряжения фотосинтетических единиц in vivo существуют разные мнения. Тем не менее, этот эффект удается четко воссоздать на модельной системе – при сравнении мономерной и димерной форм комплексов ФС2. Здесь мономер является аналогом изолированной ФСЕ, а димер – аналогом двух тесно взаимодействующих ФСЕ. Образование димерной формы ФС2 на этапе выделения обеспечивается тщательной отмывкой комплексов от липидов мембран с помощью детергента.

В план задачи входит:

  • выделение мономеров и димеров ФС2 из листьев шпината (листьев гороха или клеток хлореллы);
  • регистрация индукционных кривых флуоресценции хлорофилла от полученных препаратов ФС2 в присутствии экзогенного акцептора электронов;
  • построение компьютерной модели, описывающей индукционные кривые флуоресценции изолированного комплекса ФС2 и его димера во временном диапазоне 0-1000 мкс;
  • подбор параметров модели для наилучшего сходства модельных и экспериментальных индукционных кривых;
  • расчет формы индукционной кривой для гипотетического гексамера ФС2. Предлагается сравнить свойства моно- , ди- и гексамера ФС2.

Задача №14. Взаимодействие между углеродными нанотрубками и частицами фотосистемы 2

Для регистрации экологически вредных соединений в окружающей среде, количество которых стремительно возрастает, в настоящее время активно разрабатываются биосенсоры. В основе работы биосенсоров лежит трансформация химического сигнала (связывание поллютанта – гербицида, катиона тяжелого металла и проч. – с биологическими молекулами) в электрический сигнал. Перспективным биосенсором в этом направлении считаются фотосинтетические центры 2 типа, главным образом фотосистема 1 (ФС2).

ФС2 на свету генерирует электрический потенциал и, окисляя молекулы воды, синтезирует молекулярный кислород. Обе реакции чувствительны к гербицидам, катионам тяжелых металлов, многим органическим соединениям. Кроме того, сама реакция разделения зарядов в реакционном центре ФС2 является светочувствительной. Эти свойства ФС2 определяют высокую перспективность данной бионаноструктуры при создании биосенсоров и фотосенсоров нового поколения.

В процессе разработки биосенсоров активно используются углеродные нанотрубки (УНТ), которые благодаря своим уникальным электронным свойствам могут играть роль «молекулярного провода». С целью повышения эффективности трансформации химического сигнала в электрический конструируются и исследуются гибридные структуры (биомолекула-УНТ), являющиеся основой биосенсора. В этой связи проводятся интенсивные исследования по ковалентной и нековалентной иммобилизации различных ферментов на УНТ, и влияния УНТ на свойства ферментов. В прелагаемой задаче планируется провести иммобилизацию пигмент-белкового комплекса ФС2 на УНТ и изучить влияние нанотрубок на генерацию электрического потенциала в ФС2, перенос электрона по электрон-транспортной цепи и функционирование марганцевого каталитического центра.

Цель задачи. С помощью нескольких независимых методов изучить влияние УНТ на фотохимическую эффективность функционирования частиц ФС2.

Объект.Частицы ФС2 (BBY типа) из шпината.

Методы. Измерение кинетики светоиндуцированного выделения кислорода; измерение транспорта в ФС2 с использованием спектральных и флуоресцентных методов; измерение содержания марганца в каталитическом центре кислород-выделяющего комплекса (КВК) ФС2.

План работы.

1. Ознакомление с методами работы, объектом исследования и условиями иммобилизации объекта исследования на носителе.

2. Изучение влияния УНТ при различных концентрационных соотношениях трубка/реакционный центр на эффективность работы кислород-выделяющего комплекса на донорной стороне ФС2, эффективность окисления вторичного пластохинона Qb.

3. Изучение влияния pH наружной среды на взаимодействие между УНТ и ФС2.

4. Изучение влияния УНТ на стабильность и редокс-активность марганцевого кластера в КВК в частицах Фс2 с облегченным доступом к каталитическому центру.

Предполагаемые результаты.

В процессе выполнения задачи студенты освоят метод полярографического измерения кинетики выделения (или поглощения) молекулярного кислорода ФС2, метод регистрации электрон-транспортной активности ФС2, метод измерения флуоресценции для анализа механизма переноса электронов в ФС2 и ознакомятся с методическими приемами работы с углеродными нанотрубками. Предлагается также обсудить возможный механизм взаимодействия нанотрубок с реакционным центром ФС2.